PCR (Polymerase Chain Reaction) là kĩ thuật sinh học phân tử nhằm tạo ra hàng triệu hoặc hàng tỉ bản sao trình tự ADN cụ thể trong ống nghiệm. Phương pháp này sử dụng các đoạn ADN nhân tạo ngắn (gọi là mồi hay primer) nhằm đánh dấu một đoạn cần khuếch đại trên bộ gen. Sau đó, người ta thực hiện nhân đôi nhiều lần nhằm tạo ra bản sao đoạn trình tự đó với số lượng lớn.
Phương pháp PCR do Kary Mullis phát minh vào năm 1985, ông là một nhà hóa học làm việc tại công ti công nghệ sinh học Cetus Corporation. Lúc đầu, người ta phải sử dụng một lượng lớn enzyme và bổ sung enzyme mới sau mỗi bước thực hiện do enzyme nhân đôi ADN (enzyme polymerase) dễ biến tính khi gặp nhiệt độ cao. Do đó, sau khi được phát minh, PCR được cho là kém hiệu quả và tốn nhiều thời gian.
Năm 1976, enzyme Taq polymerase được phân lập từ một vi khuẩn sống tự nhiên trong suối nước nóng. Ngay lập tức, enzyme này được ứng dụng vào kĩ thuật PCR do chúng có thể chịu được nhiệt độ cao, vì vậy enzyme mới không cần phải được thêm vào sau mỗi chu kì thực hiện.
Năm 1993, Kary Mullis được trao giải Nobel Hóa học cho phát minh ra kĩ thuật PCR. Hiện nay, phương pháp này được xem là kĩ thuật sinh học phân tử cơ bản và phổ biến trong đa số các phòng thí nghiệm trên thế giới. PCR hỗ trợ cho nghiên cứu, phòng chống dịch bệnh và pháp y.
Thành phần của phản ứng PCR
Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR bao gồm:
- Mẫu ADN: chứa trình tự mục tiêu cần khuếch đại
- Mồi (primer): các đoạn ADN ngắn được tổng hợp nhân tạo, chúng có nhiệm vụ bám vào hai đầu trình tự mục tiêu nhằm đánh dấu vị trí cần nhân bản. Các mồi này thường được tổng hợp bằng phương pháp hóa học
- Enzyme ADN polymerase: enzyme có chức năng tổng hợp mạch ADN mới
- dNTPs (A, T, G, C): nguyên liệu cấu tạo nên ADN
- Dung dịch đệm: tạo môi trường tối ưu cho enzyme hoạt động hiệu quả
- Muối magie clorua: kích hoạt enzyme ADN polymerase
Các bước thực hiện
Người ta cho đầy đủ các thành phần phản ứng vào một ống li tâm nhỏ rồi đưa vào máy luân nhiệt, sau đó họ thiết lập các điều kiện của quy trình nhiệt. Một quy trình nhân đôi bao gồm các bước biến tính, ủ và kéo dài mạch ADN.
Bước 1: Biến tính
Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt lên 94-95°C trong 15-30 giây. Nhiệt độ cao phá vỡ liên kết giữa các base trong 2 mạch ADN khuôn, dẫn đến phân tử ADN tách ra thành 2 mạch đơn. Các ADN đơn là khuôn mẫu tạo ra bản sao mới. Bước này cần được duy trì nhiệt độ đủ lâu nhằm đảm bảo các sợi ADN tách hoàn toàn.
Bước 2: Ủ
Máy hạ nhiệt độ xuống 50-65°C nhằm tạo điều kiện cho các mồi gắn vào vị trí cụ thể trên ADN đơn. Các mồi bám vào ADN tạo nên vùng ADN kép ngắn làm điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp ADN.
Bước 3: Kéo dài
Máy luân nhiệt tăng nhiệt độ lên 72°C tạo điều kiện cho enzyme Taq polymerase tổng hợp ADN. Taq polymerase sẽ sắp xếp các base nitơ A, T, G và C thành mạch ADN mới dựa theo trình tự mạch khuôn. Thời gian thực hiện bước này tùy thuộc độ dài chuỗi ADN cần khuếch đại, thường 1 phút cho 1.000 cặp base.
Chu trình nhiệt thường lặp lại 20-40 lần (tùy theo quá trình cài đặt máy luân nhiệt) nhằm tạo ra nhiều bản sao trình tự ADN. Các đoạn ADN mới tạo ra trong chu trình trước sẽ làm khuôn mẫu cho enzyme gắn vào và tổng hợp ADN trong chu trình tiếp theo. Do đó, số lượng lớn bản sao của đoạn ADN mục tiêu được tạo ra trong khoảng thời gian tương đối ngắn.
Ứng dụng của kĩ thuật PCR
Phát hiện vi sinh vật gây bệnh
Kĩ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm. Phương pháp này có thể khuếch đại trình tự ADN của virus hoặc vi khuẩn trong mẫu dịch bệnh nhân. Sau đó, các xét nghiệm khác được tiến hành nhằm kiểm tra mẫu có đang nhiễm virus hoặc vi khuẩn không. Cặp mồi được thiết kế sao cho nó chỉ bám vào ADN mục tiêu, do đó phương pháp này hiếm khi cho kết quả nhầm lẫn với các vi sinh vật khác. Trong đại dịch COVID-19, PCR được xem là phương pháp chẩn đoán phổ biến và đáng tin cậy. Bên cạnh đó, kĩ thuật này còn thường được sử dụng trong phát hiện AIDS, viêm gan C hoặc chlamydia.
Kĩ thuật PCR còn có thể phát hiện các mầm bệnh, vi khuẩn và virus gây hại trong thực phẩm, ngay cả khi chúng hiện diện với mức độ rất thấp. PCR có khả năng khuếch đại ADN mục tiêu của mầm bệnh lên hàng triệu lần, do đó người ta có thể xác định chính xác vi sinh vật gây bệnh có mặt trong sản phẩm như thịt, cá, sữa, trứng, rau củ… Chính vì vậy, các cơ sở sản xuất và phân phối thực phẩm có thể sàng lọc nguyên liệu đầu vào nhằm bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.
Chẩn đoán bệnh di truyền
Phương pháp PCR có thể ứng dụng trong chẩn đoán bệnh di truyền bằng cách nhân bản một trình tự ADN nghi ngờ mang đột biến. Kết quả thu được giúp phát hiện các thay đổi trong gen ngay cả khi các đột biến này xảy ra trong một lượng nhỏ tế bào.
Ứng dụng trong công nghệ sinh học
Dựa vào phản ứng PCR, người ta có thể thu được số lượng lớn trình tự ADN mong muốn. Phương pháp này chỉ khuếch đại trình tự mục tiêu mà không khuếch đại các trình tự khác, do đó ADN mục tiêu thu được ít tạp nhiễm. Các gen thu được có thể được chuyển vào trong sinh vật khác nhằm tạo ra những sinh vật biến đổi gen hoặc thu nhận protein tái tổ hợp.
Ứng dụng trong khoa học pháp y
Phản ứng PCR có vị trí thiết yếu trong xác định danh tính tội phạm. Mẫu ADN từ các vật chứng tại hiện trường như máu, tóc hoặc nước tiểu được thu thập rồi khuếch đại bằng PCR. Phương pháp này rất hữu ích trong trường hợp mẫu ADN thu tại hiện trường vụ án ít và có chất lượng thấp. Người ta tiến hành so sánh mẫu ADN thu được với ADN của nghi phạm hoặc cơ sở dữ liệu nhằm tìm ra hung thủ. Bên cạnh đó, kĩ thuật này cũng được ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ cha con, xác định thủ phạm trong các vụ xâm hại tình dục hoặc xác nhận danh tính nạn nhân trong các vụ mất tích.
Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR
Ưu điểm
- Dễ thực hiện
- Có thể phát hiện virus hiện diện với số lượng ít trong mẫu
- Phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thời gian ngắn hơn so với các phương pháp truyền thống
- Thu được số lượng lớn gen mục tiêu với nguyên liệu đầu vào ít, phù hợp trong sản xuất công nghiệp
Nhược điểm
- Có thể xảy ra hiện tượng dương tính giả khi bộ mồi bắt vào một trình tự khác không phải trình tự mục tiêu
- Cần biết chính xác trình tự hai đầu gen mục tiêu để tạo đoạn mồi
- PCR rất nhạy cảm với ô nhiễm, do đó một lượng nhỏ ADN không sạch (nhiễm protein, ARN) có thể dẫn đến kết quả sai lệch hoặc không rõ ràng
- ADN polymerase dễ lỗi và có khả năng gây đột biến trên sản phẩm PCR
Các cải tiến công nghệ
Realtime PCR
Đối với phương pháp PCR truyền thống, số lượng bản sao ADN chỉ được xác định tương đối tại thời điểm kết thúc phản ứng. Trong khi đó, realtime PCR cho phép định lượng chính xác số lượng bản sao ADN sau mỗi chu kì.
Trong phương pháp realtime PCR, người ta đưa vào phản ứng một phân tử có khả năng phát huỳnh quang. Khi số lượng bản sao ADN tạo ra càng nhiều, tín hiệu huỳnh quang càng cao. Người ta gắn một bộ phận theo dõi tính hiệu huỳnh quang vào máy luân nhiệt nhằm xác định số lượng trình tự ADN theo thời gian thực. Do đó, phương pháp này còn được gọi là PCR định lượng (quantitative PCR).
Droplet digital PCR (ddPCR)
Droplet digital PCR là kĩ thuật PCR sử dụng hệ thống giọt nhũ tương nước-dầu. Hệ thống này tạo ra hàng nghìn giọt nhũ tương nước-dầu có chứa ADN bên trong. Các giọt nhũ tương có chức năng tương tự như ống nghiệm, chúng cung cấp môi trường cho ADN nhân đôi. Phương pháp này giúp định lượng chính xác và dễ dàng ADN mục tiêu, đồng thời giảm lượng hóa chất và mẫu cần sử dụng cho phản ứng.
Multiplex PCR
Đây là phương pháp phát hiện đồng thời nhiều trình tự ADN mục tiêu chỉ trong một giếng phản ứng bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau. Kĩ thuật này giúp tối ưu hóa chi phí và thời gian thực hiện phản ứng. Hiện nay, người ta sử dụng phổ biến multiplex PCR trong nghiên cứu khoa học, chẩn đoán lâm sàng và khoa học pháp y.
Reverse transcriptase ARN (RT-PCR )
RT-PCR là phương pháp khuếch đại ARN thay vì ADN nên chúng thường ứng dụng nhằm phát hiện các chủng virus có vật liệu di truyền ARN như SARS-CoV. RT-PCR sử dụng một enzyme chuyển phân tử ARN thành phân tử ADN. Các cặp mồi sau đó được gắn vào phân tử ADN này; các bước trong quy trình tương tự với PCR truyền thống.
Lời kết
Phản ứng PCR là một công cụ mang tính cách mạng trong lĩnh vực sinh học phân tử. Kĩ thuật này mở ra những ứng dụng to lớn trong y học, pháp y, nghiên cứu gen và nhiều lĩnh vực khác. Các kĩ thuật tiên tiến dựa trên PCR càng khai phá thêm tiềm năng ứng dụng như real-time PCR hay droplet digital PCR. Hiện nay, PCR đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện đại.
