Deoxyribonuclease I (DNase I) là một endonuclease, ứng dụng của nó không chỉ để duy trì tính toàn vẹn của RNA mà còn để phân tích dấu chân DNA, tạo ra các thư viện DNA ngẫu nhiên, giảm độ dính trong dịch phân giải tế bào hoặc chiết xuất protein, v.v. Nói một cách ngắn gọn, DNase I có thể được sử dụng trong hầu hết mọi ứng dụng đòi hỏi phải cắt DNA bằng enzyme. Sau đây là phần giới thiệu chi tiết về DNase I và ứng dụng cụ thể của nó.
1. DNase I là gì?2. DNase I để chuẩn bị chiết xuất RNA không có DNA3. DNase I cho phiên mã trong ống nghiệm để loại bỏ DNA khuôn mẫu4. DNase I để loại bỏ rRNA5. DNase I để gắn nhãn DNA6. Các ứng dụng khác7. Hướng dẫn lựa chọn sản phẩm DNase I
1. DNase I là gì?
Deoxyribonuclease I (DNase I) là một endonuclease không đặc hiệu có thể tiêu hóa DNA mạch đơn hoặc mạch kép, có trong các mô và dịch cơ thể khác nhau. Nó có thể thủy phân các liên kết phosphodiester để tạo ra các mono- và oligodeoxynucleotide chứa nhóm 5′-phosphate và nhóm 3′-OH. Khoảng pH hoạt động tối ưu của DNase I là 7-8, hoạt động của nó phụ thuộc vào Ca2+ và có thể được hoạt hóa bởi các ion kim loại hóa trị hai như Mn2+, Mg2+, Zn2+, v.v. Khi có Mg2+, DNase I cắt ngẫu nhiên bất kỳ vị trí nào của DNA mạch kép; khi có Mn2+, DNase I có thể cắt DNA mạch kép tại cùng một vị trí để tạo thành một đầu tù hoặc một đầu dính 1-2 nucleotide nhô ra.
Hình 1. Sơ đồ phân cắt dsDNA bởi DNase I khi có mặt Mg2+ và Mn2+.
Mặc dù sự cắt DNase I thường được coi là sự cắt không đặc hiệu, DNase I có nhiều khả năng tác động lên một số đoạn trình tự nhất định, chẳng hạn như vùng rãnh nhỏ, và dễ bị cắt các trình tự purine-pyrimidine hơn. Tuy nhiên, khi DNase I tác động lên dsDNA không đồng nhất, cả bốn bazơ sẽ bị cắt và tác động lên một bazơ cụ thể sẽ không lớn hơn 3 lần so với các bazơ khác.
2. DNase I để chuẩn bị chiết xuất RNA không có DNA
Trong các thí nghiệm sinh học, bước đầu tiên là chuẩn bị axit nucleic để nghiên cứu các chức năng khác nhau của RNA. Tuy nhiên, vì DNA và RNA thường được giải phóng cùng nhau trong quá trình ly giải tế bào, nên sự can thiệp vào cả hai không thể tránh khỏi bất kể sử dụng dung dịch chiết xuất nào, do đó cần sử dụng các enzyme cụ thể để loại bỏ sự can thiệp. Để chiết xuất RNA chất lượng cao, DNase I được sử dụng để loại bỏ DNA còn sót lại khỏi mẫu.
DNase I có thể phân hủy DNA mạch kép và mạch đơn thành oligonucleotide và nucleotide đơn, và DNA trong sản phẩm chuẩn bị RNA có thể bị phân hủy hiệu quả. DNase I sau đó bị bất hoạt bằng cách đun nóng với đệm dừng. Trong quá trình đun nóng, cấu trúc kẹp tóc của phân tử RNA có thể được mở ra, tạo điều kiện cho RNA đi trực tiếp vào quá trình phiên mã ngược.Chất lượng của RNA sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến dữ liệu thực nghiệm ở mức độ lớn. Nhìn chung, không thể tránh hoàn toàn các dư lượng gDNA trong quá trình chiết xuất RNA, do đó, người ta thường khuyến nghị xử lý các mẫu RNA bằng DNase I để tiêu hóa gDNA còn sót lại trước khi thử nghiệm các ứng dụng hạ nguồn (ví dụ: phân tích biểu hiện mRNA, phân tích phiên mã, v.v.). Bước tiêu hóa gDNA có thể được thực hiện trong quá trình chiết xuất RNA, sau khi chiết xuất RNA hoặc trước khi phiên mã ngược RNA.Theo định vị sản phẩm, các sản phẩm được cung cấp bởi Yeasen như sau:
Bảng 1: Danh sách các sản phẩm liên quan đến việc loại bỏ DNA của quá trình chiết xuất RNA hoặc trước khi phiên mã ngược
3. DNase I cho phiên mã trong ống nghiệm để loại bỏ DNA khuôn mẫu
Phiên mã trong ống nghiệm (IVT) chủ yếu sử dụng DNA làm khuôn mẫu, cùng với các chất nền và chất đệm tương ứng để thu được RNA thông qua phiên mã trong ống nghiệm. Trong các thí nghiệm phiên mã trong ống nghiệm, RNA polymerase như T7, T3 và SP6 thường được sử dụng để tổng hợp RNA. RNA tổng hợp có thể có các dư lượng DNA. Việc loại bỏ các dư lượng DNA có lợi cho việc phát triển các thí nghiệm hạ nguồn. Ví dụ, trong giai đoạn phát triển vắc-xin mRNA, việc loại bỏ các dư lượng là một bước quan trọng, có thể làm giảm khó khăn trong quá trình tinh chế hạ nguồn và tăng độ tinh khiết của sản phẩm. Khuôn mẫu DNA thường được loại bỏ bằng cách sử dụng DNase I tái tổ hợp (không có RNase).Theo quá trình tổng hợp mRNA, các sản phẩm được cung cấp bởi Yeasen như sau:
